Introducere
Cromatografia pe coloană este o extensie a cromatografiei pe strat subțire (TLC). Se presupune că cititorul are o anumită experiență în practica de laborator și a avut de-a face cu cromatografia în strat subțire. În loc să se aplice o probă pe un strat subțire de siliciu sau alumină, o probă se depune pe un cilindru de adsorbant, iar solventul este aplicat continuu cu presiune până când componentele se scurg complet din cilindru. Cu această modificare, componentele pot fi nu numai separate, ci și colectate în recipiente diferite, permițând purificarea amestecurilor și separarea medicamentelor cu poluanți. Cromatografia pe coloană (cunoscută și sub denumirea de "cromatografie flash") este frecvent utilizată în mediul de cercetare, după cum o demonstrează apariția sa frecventă în secțiunile procedurale ale articolelor din reviste.
Discuții procedurale
Aceleași principii care stau la baza cromatografiei pe strat subțire (TLC) se aplică și cromatografiei pe coloană. De fapt, înainte de realizarea unei coloane, se efectuează întotdeauna o CLT pentru a evalua situația și a determina raportul adecvat de solvenți. Pentru a obține o separare bună, este ideal ca componenta dorită să aibă un Rf de aproximativ 0,35 (citiți despre Rf în subiectul TLC) și să fie separată de alte componente cu cel puțin 0,2 unități Rf. Dacă petele care trebuie separate sunt foarte apropiate (dacă diferența în Rf este < 0,2), cel mai bine este ca mijlocul petelor să aibă un Rf de 0,35. O Rf apropiată de 0,35 este ideală deoarece este suficient de lentă pentru a permite echilibrarea fazei staționare-mobile, dar suficient de rapidă pentru a minimiza lărgirea benzii din cauza difuziei.
Există câteva variabile care nu sunt aplicabile la TLC, dar care afectează separarea componentelor în cromatografia pe coloană. Acestea includ diametrul coloanei, cantitatea de adsorbant utilizată și debitul solventului. Pic. 1 prezintă recomandări variabile în funcție de mărimea probei și de gradul de separare între componente. În toate scenariile, coloanele trebuie să fie pregătite între 12,5-15 cm înălțime.
Există câteva variabile care nu sunt aplicabile la TLC, dar care afectează separarea componentelor în cromatografia pe coloană. Acestea includ diametrul coloanei, cantitatea de adsorbant utilizată și debitul solventului. Pic. 1 prezintă recomandări variabile în funcție de mărimea probei și de gradul de separare între componente. În toate scenariile, coloanele trebuie să fie pregătite între 12,5-15 cm înălțime.
De exemplu, o coloană de 2,5 cm ar trebui să poată purifica aproximativ 400 mg de material dacă separarea este bună (ΔRf > 0,2, a treia coloană din fig. 1), sau aproximativ 160 mg dacă separarea este dificilă (ΔRf > 0,1). Coloana ar trebui să poată fi pregătită și eluată folosind aproximativ 200 ml de solvent, iar fracțiunile pot fi colectate cu aproximativ 10 ml de soluție fiecare.
Există mai multe variante privind modul fizic de funcționare a unei coloane. O mare diferență între metode este modul în care este pregătită coloana. În metoda "dry packing", siliciul sau alumina uscată se adaugă direct într-o coloană, iar solventul este lăsat să se scurgă prin coloană în porții, apoi sub presiune. În metoda "împachetării umede", coloana se umple mai întâi cu solvent, apoi siliciul sau alumina uscată se agită ușor, apoi se împachetează cu presiune. În metoda "slurry", solventul se adaugă siliciului sau aluminei într-un balon Erlenmeyer, se toarnă pe coloană sub formă de suspensie, apoi se presează (presiunea poate fi produsă cu seringa).
Este important de știut că se eliberează căldură atunci când se adaugă solvent la silice sau la alumină (acestea au o căldură exotermică de solvatare). Metoda slurry este prezentată în această secțiune, principalul motiv fiind acela că permite ca această etapă exotermică să aibă loc într-un balon Erlenmeyer în loc de coloană. Dacă se eliberează căldură în timpul ambalării coloanei, aceasta poate genera bule de la fierberea solventului. Acestea pot interfera cu separarea coloanei dacă nu sunt îndepărtate corespunzător și pot fisura materialul adsorbant din coloană.
Există mai multe variante privind modul fizic de funcționare a unei coloane. O mare diferență între metode este modul în care este pregătită coloana. În metoda "dry packing", siliciul sau alumina uscată se adaugă direct într-o coloană, iar solventul este lăsat să se scurgă prin coloană în porții, apoi sub presiune. În metoda "împachetării umede", coloana se umple mai întâi cu solvent, apoi siliciul sau alumina uscată se agită ușor, apoi se împachetează cu presiune. În metoda "slurry", solventul se adaugă siliciului sau aluminei într-un balon Erlenmeyer, se toarnă pe coloană sub formă de suspensie, apoi se presează (presiunea poate fi produsă cu seringa).
Este important de știut că se eliberează căldură atunci când se adaugă solvent la silice sau la alumină (acestea au o căldură exotermică de solvatare). Metoda slurry este prezentată în această secțiune, principalul motiv fiind acela că permite ca această etapă exotermică să aibă loc într-un balon Erlenmeyer în loc de coloană. Dacă se eliberează căldură în timpul ambalării coloanei, aceasta poate genera bule de la fierberea solventului. Acestea pot interfera cu separarea coloanei dacă nu sunt îndepărtate corespunzător și pot fisura materialul adsorbant din coloană.
Proceduri pas cu pas
a) TLC a amestecului ferocen/acetilferrocen, b) Cromatografie pe coloană
Coloana prezentată în această secțiune arată purificarea unei probe de 0,20 g care conține un amestec de ferocenă și acetilferrocenă (TLC brută este în Fig.2 a). S-au colectat fracții de aproximativ 8 ml în eprubete mici și s-au folosit aproximativ 400 ml de eluent.
a) Placa TLC a amestecului brut de ferocene/acetilferrocene înainte de eluție, b) După eluție, c) Coloană cu frită, d) Coloană cu bumbac prins în fund, e) Coloană fără bumbac (ar trebui introdus înainte de utilizare)
Efectuarea unei TLC
1) Efectuați o TLC pe proba care urmează să fie purificată (Fig.3 a și b) pentru a determina solventul adecvat pentru cromatografie. Componenta dorită ar trebui să aibă un Rf de aproximativ 0,35 și, în mod ideal, ar trebui să fie separată de toate celelalte pete cu cel puțin 0,2 unități Rf.
2) Pregătiți un lot de eluent care să ofere valoarea Rf corespunzătoare. Cantitatea preparată depinde de cantitatea de probă, de mărimea coloanei și de faptul dacă se planifică schimbarea compoziției solventului la jumătatea drumului. (A se vedea Fig. 1 pentru orientări și seria eluotropică pentru tendințele în "puterea solventului").
2) Pregătiți un lot de eluent care să ofere valoarea Rf corespunzătoare. Cantitatea preparată depinde de cantitatea de probă, de mărimea coloanei și de faptul dacă se planifică schimbarea compoziției solventului la jumătatea drumului. (A se vedea Fig. 1 pentru orientări și seria eluotropică pentru tendințele în "puterea solventului").
Pregătirea coloanei ambalate
3) Obțineți o coloană adecvată (a se vedea Fig. 1) și asigurați-vă că există ceva în apropierea robinetului care să permită trecerea lichidului, dar nu a solidului. Coloanele pot avea un disc sinterizat (cunoscut și sub numele de "frită"), Fig.3 c), sau un dop de vată sau vată de sticlă rămas de la utilizatorul anterior (Fig.3 d). Dacă nu există niciun disc sau dop (Fig.3 e), introduceți un mic tampon de vată sau vată de sticlă în fundul coloanei cu ajutorul unei tije lungi.
a) Turnarea silicei până la 12,5-15 cm înălțime în hota de fum, b) Turnarea silicei într-un balon Erlenmeyer, c și d) Realizarea unei suspensii
Notă privind siguranța: pulberea de siliciu și alumină sunt iritante pentru plămâni și trebuie manipulate întotdeauna cu atenție într-o hotă. Praful vărsat trebuie eliminat prin ștergere cu un prosop de hârtie umed (dacă este umed, particulele fine sunt mai puțin dispersive).
5) În hotă, turnați adsorbantul măsurat în coloană într-un balon Erlenmeyer (Fig.4 b), apoi adăugați puțin eluent (Fig.4 c). Faceți o suspensie liberă prin rotire și agitare cu o tijă de agitare din sticlă (Fig.4 d) până când tot adsorbantul este complet umed, bulele de gaz sunt eliberate, iar consistența este oarecum groasă, dar turnabilă.
a) Turnarea suspensiei în coloană, b) Clătirea balonului, c) Adsorbantul aderat la părțile laterale ale coloanei, d) Clătirea adsorbantului aderent
6) Puneți un pahar de laborator sau un balon Erlenmeyer sub coloana fixată și deschideți robinetul de închidere. Dintr-o mișcare rapidă, agitați și turnați suspensia de silice sau alumină în coloană folosind o pâlnie cu gura mare (fig. 5 a). Utilizați imediat mai mult eluent pentru a clăti suspensia reziduală din balonul Erlenmeyer (Fig. 5 b) și pe coloană.
7) Clătiți imediat siliciul sau alumina de pe părțile laterale ale rezervorului coloanei folosind eluant și o mișcare de rotație a unei pipete Pasteur (Fig.5 c și d). Dacă se lasă să se usuce, adsorbantul se va agăța de sticlă și nu va putea fi clătit ușor.
7) Clătiți imediat siliciul sau alumina de pe părțile laterale ale rezervorului coloanei folosind eluant și o mișcare de rotație a unei pipete Pasteur (Fig.5 c și d). Dacă se lasă să se usuce, adsorbantul se va agăța de sticlă și nu va putea fi clătit ușor.
a) Zdruncinarea coloanei pentru a elimina bulele de aer, b) Aplicarea presiunii aerului, c) Adăugarea nisipului, d) Clătirea nisipului de pe părți
8) Împingeți coloana cu fermitate folosind un inel de plută sau încheieturile mâinilor (Fig. 6 a) pentru a îndepărta eventualele bule de aer din coloană (care ar putea provoca o separare deficitară sau fisurarea adsorbantului în coloană) și pentru a favoriza o depunere uniformă a adsorbantului.
9) Aplicați o ușoară presiune cu aer în partea superioară a coloanei (Fig.6 b) pentru a o comprima, oprindu-vă atunci când nivelul eluantului se află la 1 cm de partea superioară a coloanei. Dacă se utilizează un adaptor în T cu conducta de aer ca în Fig.6 b, se poate realiza un control fin al debitului de aer prin ajustarea clemei de strângere de pe tubulatura de cauciuc. Pe parcursul întregului proces de eluție, se menține umedă coloana albă de adsorbant, cu nivelul eluentului deasupra părții superioare a siliciului sau aluminei. Rupeți ușor sigiliul pentru a înceta aplicarea presiunii și închideți robinetul pentru a preveni scurgerea în continuare a lichidului.
10) Adăugați un strat subțire de nisip (Fig.6 c), de aproximativ 0,5 cm înălțime. Clătiți părțile laterale ale coloanei cu eluant folosind o mișcare de rotire pentru a dezlipi nisipul de pe părțile laterale ale sticlei (Fig.6 d). Deschideți robinetul de închidere și lăsați lichidul să picure până când lichidul se află chiar deasupra stratului de nisip. Aplicați presiune de aer dacă picurarea este prea lentă.
9) Aplicați o ușoară presiune cu aer în partea superioară a coloanei (Fig.6 b) pentru a o comprima, oprindu-vă atunci când nivelul eluantului se află la 1 cm de partea superioară a coloanei. Dacă se utilizează un adaptor în T cu conducta de aer ca în Fig.6 b, se poate realiza un control fin al debitului de aer prin ajustarea clemei de strângere de pe tubulatura de cauciuc. Pe parcursul întregului proces de eluție, se menține umedă coloana albă de adsorbant, cu nivelul eluentului deasupra părții superioare a siliciului sau aluminei. Rupeți ușor sigiliul pentru a înceta aplicarea presiunii și închideți robinetul pentru a preveni scurgerea în continuare a lichidului.
10) Adăugați un strat subțire de nisip (Fig.6 c), de aproximativ 0,5 cm înălțime. Clătiți părțile laterale ale coloanei cu eluant folosind o mișcare de rotire pentru a dezlipi nisipul de pe părțile laterale ale sticlei (Fig.6 d). Deschideți robinetul de închidere și lăsați lichidul să picure până când lichidul se află chiar deasupra stratului de nisip. Aplicați presiune de aer dacă picurarea este prea lentă.
Adăugarea probei
Odată ce eșantionul este aplicat pe coloană, există o cursă contra cronometru, deoarece difuzia va începe să lărgească materialul. Nu trebuie aplicată o probă până când nu sunteți gata să completați coloana imediat și în întregime. Acest proces poate dura între 15 și 90 de minute! Dacă utilizați eprubete pentru colectarea fracțiilor, eprubetele trebuie aranjate într-un suport înainte de adăugarea probei, iar înălțimea coloanei trebuie reglată astfel încât suportul pentru eprubete să poată aluneca pe dedesubt.
a) Dizolvarea unui solid cu o cantitate mică de diclormetan, b) Aplicarea probei, c) Clătirea probei în balonul său, d) Aplicarea unei presiuni pentru a împinge proba pe coloană imediat după stratul de nisip
11) Dacă proba brută este un lichid, se utilizează direct (treceți la etapa 13).
12) În cazul în care proba brută este solidă, efectuați una dintre următoarele operații.
12) În cazul în care proba brută este solidă, efectuați una dintre următoarele operații.
a) Situația ideală: dizolvați solidul în cantitatea minimă de eluent (cel mult câțiva ml).
b) Dacă solidul nu este deosebit de solubil sau nu se dizolvă în câțiva ml de eluent, dizolvați-l în cantitatea minimă de diclormetan (cel mult câțiva ml, Fig.7 a).
c) Dacă solidul este insolubil în eluent, este posibilă și o procedură alternativă. Se dizolvă solidul într-un balon cu fundul rotund folosind câțiva ml de solvent cu punct de fierbere scăzut (de exemplu diclormetan sau acetonă). Se adaugă în balon aproximativ 1 g de silice sau alumină, apoi se îndepărtează solventul pe evaporator rotativ pentru a lăsa un solid care conține proba depusă pe adsorbant. Cu un centimetru de eluent așezat deasupra coloanei umplute (nu se adaugă stratul de nisip dacă se utilizează această metodă), se toarnă proba adsorbită de siliciu pe coloană cu ajutorul unei pâlnii cu gura largă. Dacă rămâne praf pe sticlă, clătiți-o cu mai mult eluent (treceți la etapa 15).
13) Adăugați cu delicatețe proba în coloană prin pipetă, picurând lichidul sau soluția direct pe nisip cu vârful pipetei cât mai aproape posibil, nu pe laturi (Fig.7 b). Aveți grijă să nu stropiți lichidul în mod forțat, astfel încât să se producă adâncituri în nisip sau în coloana de silice/alumină.
14) Clătiți recipientul pentru probe cu puțin solvent (sau diclormetan dacă este utilizat, Fig.7 c) și adăugați clătirea în coloană folosind aceeași pipetă (pentru a clăti și pipeta).
15) Deschideți robinetul de închidere și lăsați lichidul să se scurgă până când proba trece de stratul de nisip (Fig.7 d) și ajunge în zona albă a coloanei (aplicați presiune de aer dacă acest lucru durează mai mult de 20 de secunde).
16) Clătiți ușor părțile laterale ale coloanei cu o mișcare de rotire folosind 1-2 pipete pline cu eluant pentru a clăti orice probă stropită. Din nou, lăsați lichidul să se scurgă (sau aplicați presiune de aer) până când proba este împinsă în adsorbantul alb.
Repetați etapa de clătire până când sunteți sigur că întreaga probă este depusă pe adsorbant. Dacă o parte din probă se află încă în stratul de nisip, aceasta se poate dizolva în eluent atunci când se adaugă mai mult solvent, ceea ce duce la o pierdere de randament. Dacă compusul este colorat, clătirea trebuie să fie complet clară.
14) Clătiți recipientul pentru probe cu puțin solvent (sau diclormetan dacă este utilizat, Fig.7 c) și adăugați clătirea în coloană folosind aceeași pipetă (pentru a clăti și pipeta).
15) Deschideți robinetul de închidere și lăsați lichidul să se scurgă până când proba trece de stratul de nisip (Fig.7 d) și ajunge în zona albă a coloanei (aplicați presiune de aer dacă acest lucru durează mai mult de 20 de secunde).
16) Clătiți ușor părțile laterale ale coloanei cu o mișcare de rotire folosind 1-2 pipete pline cu eluant pentru a clăti orice probă stropită. Din nou, lăsați lichidul să se scurgă (sau aplicați presiune de aer) până când proba este împinsă în adsorbantul alb.
Repetați etapa de clătire până când sunteți sigur că întreaga probă este depusă pe adsorbant. Dacă o parte din probă se află încă în stratul de nisip, aceasta se poate dizolva în eluent atunci când se adaugă mai mult solvent, ceea ce duce la o pierdere de randament. Dacă compusul este colorat, clătirea trebuie să fie complet clară.
a și b) Umplerea rezervorului de solvent, c și d) Eluția coloanei
Umplerea cu eluant și eluarea coloanei
17) Adăugați delicat mai mult eluant prin pipetă (Fig. 8 a), învârtind pe margini, apoi, când stratul de nisip nu va mai fi deranjat de adăugiri, turnați cu grijă cantități mai mari (Fig. 8 b) din eluantul preparat pentru a umple rezervorul (sau umpleți cu atât cât poate fi necesar). Eluentul curat colectat în timpul ambalării coloanei poate fi reutilizat.
18) Utilizați presiunea aerului pentru a elua ușor și constant proba prin coloană (Fig.8 c și d). Cu cât presiunea este pornită și oprită de mai multe ori, cu atât este mai probabil ca coloana să se fisureze. Cel mai bine este ca presiunea să poată fi menținută ușor și constant tot timpul.
Rata optimă de picurare în timpul eluției depinde de dimensiunea coloanei. Fluxul ideal de eluent este atunci când solventul din secțiunea cilindrică a coloanei de deasupra adsorbantului scade cu 5 cm pe minut. Prin urmare, viteza de scurgere ar trebui să fie mai mică la o coloană îngustă decât la o coloană mai lată. Viteza de scurgere pentru o coloană de 2,5 cm ar trebui să fie la un nivel la care abia se pot distinge picăturile individuale. Un jet de lichid care se scurge din robinet cu această dimensiune a coloanei este ușor prea rapid.
18) Utilizați presiunea aerului pentru a elua ușor și constant proba prin coloană (Fig.8 c și d). Cu cât presiunea este pornită și oprită de mai multe ori, cu atât este mai probabil ca coloana să se fisureze. Cel mai bine este ca presiunea să poată fi menținută ușor și constant tot timpul.
Rata optimă de picurare în timpul eluției depinde de dimensiunea coloanei. Fluxul ideal de eluent este atunci când solventul din secțiunea cilindrică a coloanei de deasupra adsorbantului scade cu 5 cm pe minut. Prin urmare, viteza de scurgere ar trebui să fie mai mică la o coloană îngustă decât la o coloană mai lată. Viteza de scurgere pentru o coloană de 2,5 cm ar trebui să fie la un nivel la care abia se pot distinge picăturile individuale. Un jet de lichid care se scurge din robinet cu această dimensiune a coloanei este ușor prea rapid.
a-c) Colectarea fracțiilor, d) Rularea unei coloane
Colectarea fracțiilor
19) Începeți imediat colectarea lichidului de eluție în eprubete pe un suport (Fig.9 a). A se vedea Fig.1 pentru recomandări privind volumele care trebuie colectate în fiecare eprubetă.20) Când prima eprubetă se umple sau dacă a fost colectată o anumită înălțime de lichid, conform recomandărilor instructorului sau Fig.1, mutați suportul pentru a începe colectarea într-un alt tub (Fig.9 b și c). Umpleți și păstrați tuburile în ordine pe suport.
Aceste tuburi diferite se numesc "fracții". Scopul unei coloane este de a colecta fracții suficient de mici încât majoritatea (sau unele) fracțiilor să conțină material pur. Dacă separarea amestecului este dificilă (dacă ΔRf al componentelor este scăzut), poate fi mai bine să colectați fracții mici (de exemplu, tuburi umplute pe jumătate).
Aceste tuburi diferite se numesc "fracții". Scopul unei coloane este de a colecta fracții suficient de mici încât majoritatea (sau unele) fracțiilor să conțină material pur. Dacă separarea amestecului este dificilă (dacă ΔRf al componentelor este scăzut), poate fi mai bine să colectați fracții mici (de exemplu, tuburi umplute pe jumătate).
a-c) Material de clătire împrăștiat pe vârful coloanei, d) Studenți care rulează o coloană
21) Pe măsură ce lichidul se scurge din coloană, adesea stropește pe părțile exterioare ale vârfului coloanei, iar atunci când solventul se evaporă este posibil să vedeți un inel de material pe vârf (veți vedea un inel de solid dacă componentul este un solid, ca în Fig.10 b, sau picături uleioase dacă componentul este un lichid). Dacă componentele sunt colorate, vârful coloanei trebuie clătit (Fig.10 c) atunci când pare că o componentă a fost complet elutată și înainte ca cealaltă componentă să se apropie.
22) Supravegheați periodic nivelul eluentului și reumpleți înainte ca acesta să scadă sub stratul de nisip.
22) Supravegheați periodic nivelul eluentului și reumpleți înainte ca acesta să scadă sub stratul de nisip.
a) Eluția, b) Adăugarea de acetat de etil pentru a crește polaritatea solventului, c) Nivelul solventului se apropie de stratul de nisip, d) Reumplerea
Eventual creșterea polarității solventului
23) Se poate utiliza un singur eluant pe întreaga coloană, mai ales dacă componentele care urmează să fie separate au valori Rf similare. Cu toate acestea, dacă componentele au valori Rf foarte diferite, polaritatea solventului poate fi crescută după ce un component a fost eluat din coloană (Fig.11 a).
Creșterea polarității solventului va face ca componentele să se deplaseze "mai repede". Există mai multe motive pentru care se dorește o eluție mai rapidă. În primul rând, dacă un component a ieșit deja din coloană, coloana și-a făcut deja treaba cu separarea, astfel încât accelerarea procesului nu va afecta puritatea fracțiilor colectate. În al doilea rând, cu cât durează mai mult rularea unei coloane, cu atât mai largi vor fi benzile de componente (din cauza difuziei), iar colectarea unei benzi largi de material va utiliza (și risipi) mult solvent.
Creșterea polarității solventului va face ca componentele să se deplaseze "mai repede". Există mai multe motive pentru care se dorește o eluție mai rapidă. În primul rând, dacă un component a ieșit deja din coloană, coloana și-a făcut deja treaba cu separarea, astfel încât accelerarea procesului nu va afecta puritatea fracțiilor colectate. În al doilea rând, cu cât durează mai mult rularea unei coloane, cu atât mai largi vor fi benzile de componente (din cauza difuziei), iar colectarea unei benzi largi de material va utiliza (și risipi) mult solvent.
Conține o listă parțială a seriei eluotropice, o listă de solvenți comuni clasificați în funcție de "puterea lor de solvent" în cromatografia în fază normală. Solventul mai polar determină cea mai spectaculoasă creștere a Rf
24) Pentru a crește polaritatea solventului, solventul polar poate fi picurat direct în eluent pe rezervorul coloanei (Fig.11 b). De exemplu, dacă se utilizează un amestec hexani:acetat de etil, adăugarea de acetat de etil pur la eluentul aflat în prezent în rezervor ar crește polaritatea acestuia. În cazul în care nivelul eluantului este scăzut, se poate prepara o soluție care să conțină un procent mai mare din componenta mai polară. De exemplu, dacă coloana a utilizat mai întâi un amestec 4:1 hexani:acetat de etil, utilizarea unui amestec 1:1 ar fi un solvent mai polar.
25) Eluați coloana cu solventul mai polar ca înainte și amintiți-vă întotdeauna să urmăriți nivelul eluantului și să umpleți din nou (Fig.11 d) înainte ca acesta să scadă sub stratul de nisip.
26) Pentru a crește polaritatea solventului, solventul polar poate fi picurat direct în eluent pe rezervorul coloanei (Fig.11 b). De exemplu, dacă se utilizează un amestec hexani:acetat de etil, adăugarea de acetat de etil pur la eluentul aflat în prezent în rezervor ar crește polaritatea acestuia. În cazul în care nivelul eluantului este scăzut, se poate prepara o soluție care să conțină un procent mai mare din componenta mai polară. De exemplu, dacă coloana a utilizat inițial un amestec 4:1 hexani:acetat de etil, utilizarea unui amestec 1:1 ar fi un solvent mai polar.
27) Eluați coloana cu solventul mai polar ca înainte și amintiți-vă întotdeauna să urmăriți nivelul eluantului și să umpleți din nou (Fig.11 d) înainte ca acesta să scadă sub stratul de nisip.
25) Eluați coloana cu solventul mai polar ca înainte și amintiți-vă întotdeauna să urmăriți nivelul eluantului și să umpleți din nou (Fig.11 d) înainte ca acesta să scadă sub stratul de nisip.
26) Pentru a crește polaritatea solventului, solventul polar poate fi picurat direct în eluent pe rezervorul coloanei (Fig.11 b). De exemplu, dacă se utilizează un amestec hexani:acetat de etil, adăugarea de acetat de etil pur la eluentul aflat în prezent în rezervor ar crește polaritatea acestuia. În cazul în care nivelul eluantului este scăzut, se poate prepara o soluție care să conțină un procent mai mare din componenta mai polară. De exemplu, dacă coloana a utilizat inițial un amestec 4:1 hexani:acetat de etil, utilizarea unui amestec 1:1 ar fi un solvent mai polar.
27) Eluați coloana cu solventul mai polar ca înainte și amintiți-vă întotdeauna să urmăriți nivelul eluantului și să umpleți din nou (Fig.11 d) înainte ca acesta să scadă sub stratul de nisip.
a) Placa TLC originală, b) Fracțiile colectate de coloană, c) Spotuirea fracțiilor pe o placă TLC, d) O placă TLC vizualizată cu probe din fiecare fracție
Găsirea și concentrarea componentei dorite
28) În găsirea componentei dorite în fracțiunile din eprubetă, este util să se înțeleagă relația dintre Rf și ordinea de eluție în cromatografia pe coloană.În cromatografia în coloană, proba este depusă în fruntea coloanei și elutată în jos, în timp ce în cromatografia în strat subțire, proba este punctată pe fundul plăcii și elutată în sus. Prin urmare, o coloană poate fi privită ca o placă TLC răsturnată. Un compus cu un Rf mai mare rulează "mai repede", ceea ce înseamnă că va ajunge mai sus pe o placă TLC și va fi colectat primul cu o coloană. În coloana ilustrată în această secțiune, componenta cu Rf mai scăzut (portocaliu pe placa TLC din Fig.13 a), este componenta colectată a doua din coloană.
29) Determinați mai întâi care eprubete conțin compusul dizolvat.
29) Determinați mai întâi care eprubete conțin compusul dizolvat.
a) Depuneți o probă din fiecare fracție pe o placă TLC etichetată cu numerele fracțiilor corespunzătoare ordinii în care au fost colectate (Fig.13 c). Poate fi mai bine să se depună fiecare probă de 2-3 ori una peste alta în cazul în care fracțiunile sunt diluate.
b) Dacă au fost colectate multe fracții, ceea ce vă face să ezitați să eșantionați fiecare fracție, o metodă de identificare a fracțiilor incolore care ar putea conține compus este să căutați un indiciu de reziduu care să conducă la eprubete. După evaporare, un reziduu solid (Fig.13) sau picături uleioase rămân uneori pe partea superioară a eprubetei, ceea ce face evident că fracțiunile respective conțin mai mult decât solvent. Eșantionați toate fracțiunile din apropierea eprubetelor care conțin reziduuri vizibile.
c) Vizualizați placa TLC cu pete folosind lumina UV și/sau un colorant pentru a determina care fracțiuni conțin compusul (Fig.13 d)
a) Plăcile TLC eluzionate ale fracțiilor care conțin compusul posibil, b) Combinarea fracțiilor, c) Clătirea unui tub de fracție
28) Efectuați o CLT a tuturor fracțiilor care conțin compus, pătind până la cinci probe pe o placă CLT cu lățimea de 2,5 cm. Se pot utiliza în acest scop plăci TLC mai late, dacă sunt disponibile.
29) Identificați compusul cu Rf dorit prin comparație cu placa TLC brută inițială. Alegeți să rețineți fracțiunile care au compusul dorit în formă pură, așa cum reiese din placa TLC elutată. De exemplu, dacă în Fig.15 a se dorește compusul cu Rf mai mare, ar trebui păstrate fracțiunile 6-10.
30) Combinați fracțiunile pure într-un balon cu fund rotund de dimensiuni adecvate (nu mai mult de jumătate plin, Fig.15 b). Clătiți fiecare eprubetă cu o cantitate mică de eluent (sau alt solvent dacă solubilitatea este o problemă) și adăugați soluția de clătire în balonul cu fund rotund (Fig.15 c).
31) Evaporați solventul pe evaporatorul rotativ pentru a lăsa compusul purificat în balon.
29) Identificați compusul cu Rf dorit prin comparație cu placa TLC brută inițială. Alegeți să rețineți fracțiunile care au compusul dorit în formă pură, așa cum reiese din placa TLC elutată. De exemplu, dacă în Fig.15 a se dorește compusul cu Rf mai mare, ar trebui păstrate fracțiunile 6-10.
30) Combinați fracțiunile pure într-un balon cu fund rotund de dimensiuni adecvate (nu mai mult de jumătate plin, Fig.15 b). Clătiți fiecare eprubetă cu o cantitate mică de eluent (sau alt solvent dacă solubilitatea este o problemă) și adăugați soluția de clătire în balonul cu fund rotund (Fig.15 c).
31) Evaporați solventul pe evaporatorul rotativ pentru a lăsa compusul purificat în balon.
a) Utilizarea presiunii aerului pentru a usca coloana, b) Permiterea uscării coloanei cu susul în jos, c) Colectarea siliciului rezidual
Curățarea coloanei
32) Pentru a usca coloana, aplicați presiune de aer pentru a scurge cea mai mare parte a eluentului din coloană într-un recipient pentru deșeuri. Apoi uscați în continuare coloana folosind una dintre aceste metode.
a) Lăsați conectat un flux ușor de aer care curge prin coloană pentru a o usca în continuare în timp ce curățați alte lucruri (Fig.16 a).
b) Prindeți coloana cu capul în jos deasupra unui pahar mare pentru deșeuri în hota de fum, astfel încât adsorbantul să cadă după ce s-a uscat (Fig.16 b). Acest lucru va dura mult timp (până la următoarea perioadă de curs), dar este o opțiune.
33) După ce s-a uscat, adsorbantul poate fi turnat din coloană într-un recipient de deșeuri în hota de fum (Fig.16 c).
Notă de siguranță: adsorbanții pulverulenți sunt iritanți pulmonari, iar pericolul lor este exacerbat dacă coloana conține compuși reziduali care pot ajunge acum în plămâni. Turnarea pulberilor de silice sau alumină trebuie să se facă întotdeauna în hotă.
34) Atunci când cea mai mare parte a adsorbantului a fost colectată într-un recipient pentru deșeuri, utilizați apă pentru a clăti orice solid rezidual în chiuvetă și apoi clătiți coloana cu acetonă într-un pahar pentru deșeuri. În continuare, curățați coloana cu apă și săpun și uscați-o cu părțile robinetului de închidere separate.
Notă de siguranță: adsorbanții pulverulenți sunt iritanți pulmonari, iar pericolul lor este exacerbat dacă coloana conține compuși reziduali care pot ajunge acum în plămâni. Turnarea pulberilor de silice sau alumină trebuie să se facă întotdeauna în hotă.
34) Atunci când cea mai mare parte a adsorbantului a fost colectată într-un recipient pentru deșeuri, utilizați apă pentru a clăti orice solid rezidual în chiuvetă și apoi clătiți coloana cu acetonă într-un pahar pentru deșeuri. În continuare, curățați coloana cu apă și săpun și uscați-o cu părțile robinetului de închidere separate.
Rezolvarea problemelor
În coloană sunt observate bule de aer
O bulă de aer este un buzunar gol în care nu are loc echilibrarea fazei staționare-mobile, astfel încât componentele se mișcă mai repede decât ar trebui în jurul unei bule de aer. Acest lucru poate duce la benzi de eluție inegale, care pot provoca suprapuneri dacă separarea amestecului este dificilă (dacă componentele au valori Rf foarte apropiate, ca în Fig.17).
Dacă se observă bule de aer în coloană și nisipul sau proba nu au fost încă aplicate, dați coloanei o zdruncinătură bună în timpul ambalării pentru a elimina toate bulele de aer. Consultați instructorul dacă bulele nu se mișcă, deoarece este posibil să abordați sarcina cu prea multă delicatețe. Dacă nisipul sau proba au fost deja aplicate, cel mai bine este să lăsați coloana așa cum este și să sperați că bulele de aer nu afectează separarea.
Benzile se eluează neuniform
Dacă componentele unui amestec sunt colorate, poate fi evident atunci când benzile eluează într-o manieră strâmbă. Acest lucru se datorează cel mai probabil faptului că coloana este fixată într-o ușoară diagonală. Dacă coloana este fixată într-o manieră înclinată, componentele se vor deplasa într-o manieră înclinată (fig. 18). Acest lucru poate cauza probleme de separare dacă componentele au un Rf similar.
Nu există nicio modalitate de a rezolva această problemă la jumătatea unei coloane, dar dacă componentele au valori Rf foarte diferite, benzile înclinate pot să nu aibă niciun efect asupra separării. Pe viitor, asigurați-vă că verificați dacă coloana este perfect verticală atât în direcția laterală, cât și în direcția față-spate.
Last edited by a moderator:
