Wprowadzenie
Chromatografia kolumnowa jest rozszerzeniem chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Zakłada się, że czytelnik ma pewne doświadczenie w praktyce laboratoryjnej i miał do czynienia z chromatografią cienkowarstwową. Zamiast nanoszenia próbki na cienką warstwę krzemionki lub tlenku glinu, próbka jest osadzana na cylindrze z adsorbentem, a rozpuszczalnik jest stale podawany pod ciśnieniem, aż składniki całkowicie spłyną z cylindra. Dzięki tej modyfikacji składniki można nie tylko oddzielić, ale także zebrać do różnych pojemników, umożliwiając oczyszczanie mieszanin i oddzielanie leków od zanieczyszczeń. Chromatografia kolumnowa (znana również jako "chromatografia flash") jest często stosowana w badaniach naukowych, o czym świadczy jej częste występowanie w sekcjach proceduralnych artykułów w czasopismach.
Omówienie procedur
Te same podstawowe zasady chromatografii cienkowarstwowej (TLC) mają zastosowanie do chromatografii kolumnowej. W rzeczywistości TLC jest zawsze wykonywana przed wykonaniem kolumny w celu oceny sytuacji i określenia właściwego stosunku rozpuszczalnika. Aby uzyskać dobrą separację, idealnie jest, jeśli pożądany składnik ma Rf około 0,35 (przeczytaj o Rf w temacie TLC) i jest oddzielony od innych składników o co najmniej 0,2 jednostki Rf. Jeśli plamki, które mają zostać rozdzielone, znajdują się bardzo blisko siebie (jeśli różnica w Rf wynosi < 0,2), najlepiej jest, jeśli środek plamki ma Rf 0,35. Współczynnik Rf bliski 0,35 jest idealny, ponieważ jest wystarczająco wolny, aby mogła wystąpić równowaga fazy stacjonarnej i ruchomej, ale wystarczająco szybki, aby zminimalizować poszerzenie pasma spowodowane dyfuzją.
Istnieje kilka zmiennych, które nie mają zastosowania do TLC, ale które wpływają na rozdzielanie składników w chromatografii kolumnowej. Obejmują one średnicę kolumny, ilość użytego adsorbentu i szybkość przepływu rozpuszczalnika. Rys. 1 przedstawia zmienne zalecenia w zależności od wielkości próbki i stopnia rozdzielenia składników. We wszystkich scenariuszach kolumny powinny być przygotowane na wysokości 12,5-15 cm.
Istnieje kilka zmiennych, które nie mają zastosowania do TLC, ale które wpływają na rozdzielanie składników w chromatografii kolumnowej. Obejmują one średnicę kolumny, ilość użytego adsorbentu i szybkość przepływu rozpuszczalnika. Rys. 1 przedstawia zmienne zalecenia w zależności od wielkości próbki i stopnia rozdzielenia składników. We wszystkich scenariuszach kolumny powinny być przygotowane na wysokości 12,5-15 cm.
Na przykład, kolumna o wysokości 2,5 cm powinna być w stanie oczyścić około 400 mg materiału, jeśli separacja jest dobra (ΔRf > 0,2, trzecia kolumna na rys. 1) lub około 160 mg, jeśli separacja jest trudna (ΔRf > 0,1). Kolumna powinna być w stanie być przygotowana i eluowana przy użyciu około 200 ml rozpuszczalnika, a frakcje mogą być zbierane przy użyciu około 10 ml roztworu każda.
Istnieje wiele wariantów fizycznego prowadzenia kolumny. Jedną z dużych różnic w metodach jest sposób przygotowania kolumny. W metodzie "suchego pakowania" sucha krzemionka lub tlenek glinu są dodawane bezpośrednio do kolumny, a rozpuszczalnik jest przepuszczany porcjami, a następnie pod ciśnieniem. W metodzie "pakowania na mokro" kolumna jest najpierw wypełniana rozpuszczalnikiem, następnie sucha krzemionka lub tlenek glinu są lekko wstrząsane, a następnie pakowane pod ciśnieniem. W metodzie "zawiesiny" rozpuszczalnik jest dodawany do krzemionki lub tlenku glinu w kolbie Erlenmeyera, wylewany na kolumnę jako szlam, a następnie pakowany pod ciśnieniem (ciśnienie można wytworzyć za pomocą strzykawki).
Ważne jest, aby wiedzieć, że ciepło jest uwalniane, gdy rozpuszczalnik jest dodawany do krzemionki lub tlenku glinu (mają one egzotermiczne ciepło solwatacji). W tej sekcji przedstawiono metodę zawiesinową, której głównym powodem jest to, że umożliwia ona przeprowadzenie tego egzotermicznego etapu w kolbie Erlenmeyera zamiast na kolumnie. Jeśli ciepło jest uwalniane podczas pakowania kolumny, może generować pęcherzyki z wrzącego rozpuszczalnika. Mogą one zakłócać separację w kolumnie, jeśli nie zostaną odpowiednio usunięte, i mogą powodować pękanie adsorbentu w kolumnie.
Istnieje wiele wariantów fizycznego prowadzenia kolumny. Jedną z dużych różnic w metodach jest sposób przygotowania kolumny. W metodzie "suchego pakowania" sucha krzemionka lub tlenek glinu są dodawane bezpośrednio do kolumny, a rozpuszczalnik jest przepuszczany porcjami, a następnie pod ciśnieniem. W metodzie "pakowania na mokro" kolumna jest najpierw wypełniana rozpuszczalnikiem, następnie sucha krzemionka lub tlenek glinu są lekko wstrząsane, a następnie pakowane pod ciśnieniem. W metodzie "zawiesiny" rozpuszczalnik jest dodawany do krzemionki lub tlenku glinu w kolbie Erlenmeyera, wylewany na kolumnę jako szlam, a następnie pakowany pod ciśnieniem (ciśnienie można wytworzyć za pomocą strzykawki).
Ważne jest, aby wiedzieć, że ciepło jest uwalniane, gdy rozpuszczalnik jest dodawany do krzemionki lub tlenku glinu (mają one egzotermiczne ciepło solwatacji). W tej sekcji przedstawiono metodę zawiesinową, której głównym powodem jest to, że umożliwia ona przeprowadzenie tego egzotermicznego etapu w kolbie Erlenmeyera zamiast na kolumnie. Jeśli ciepło jest uwalniane podczas pakowania kolumny, może generować pęcherzyki z wrzącego rozpuszczalnika. Mogą one zakłócać separację w kolumnie, jeśli nie zostaną odpowiednio usunięte, i mogą powodować pękanie adsorbentu w kolumnie.
Procedury krok po kroku
a) TLC mieszaniny ferrocen/acetyloferrocen, b) Chromatografia kolumnowa
Kolumna przedstawiona w tej sekcji pokazuje oczyszczanie 0,20 g próbki zawierającej mieszaninę ferrocenu i acetyloferrocenu (surowa TLC jest na Rys.2 a). Około 8 ml frakcji zebrano do małych probówek i zużyto około 400 ml eluentu.
a) Płytka TLC surowej mieszaniny ferrocenu/acetylferrocenu przed elucją, b) Po elucji, c ) Kolumna z frytą, d ) Kolumna z bawełnianym klinem na dnie, e) Kolumna bez bawełnianego klina (należy go włożyć przed użyciem).
PrzeprowadzenieTLC
1 ) Wykonaj TLC na próbce, która ma zostać oczyszczona (rys. 3 a i b), aby określić odpowiedni rozpuszczalnik do chromatografii. Pożądany składnik powinien mieć Rf około 0,35 i powinien być idealnie oddzielony od wszystkich innych plamek o co najmniej 0,2 jednostki Rf.
2) Przygotuj partię eluentu, który daje odpowiednią wartość Rf. Przygotowana ilość zależy od ilości próbki, wielkości kolumny i tego, czy skład rozpuszczalnika ma zostać zmieniony w połowie. (Patrz Rys. 1, aby zapoznać się z wytycznymi i serią eluotropową dla trendów w "mocy rozpuszczalnika").
2) Przygotuj partię eluentu, który daje odpowiednią wartość Rf. Przygotowana ilość zależy od ilości próbki, wielkości kolumny i tego, czy skład rozpuszczalnika ma zostać zmieniony w połowie. (Patrz Rys. 1, aby zapoznać się z wytycznymi i serią eluotropową dla trendów w "mocy rozpuszczalnika").
Przygotowanie kolumny z wypełnieniem
3 ) Uzyskaj odpowiednią kolumnę (patrz rys. 1) i upewnij się, że w pobliżu zaworu odcinającego znajduje się coś, co pozwoli na przejście cieczy, ale nie ciała stałego. Kolumny mogą mieć spiekany dysk (znany również jako "fryta") (rys. 3 c) lub korek z bawełny lub waty szklanej pozostały po poprzednim użytkowniku (rys. 3 d). Jeśli nie ma dysku lub zatyczki (rys. 3 e), należy wbić niewielki zwitek waty bawełnianej lub szklanej w dno kolumny za pomocą długiego pręta.
a ) Wsypywanie krzemionki na wysokość 12,5-15 cm w wyciągu, b ) Wsypywanie krzemionki do kolby Erlenmeyera, c i d) Sporządzanie zawiesiny
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Sproszkowana krzemionka i tlenek glinu są substancjami drażniącymi płuca i zawsze należy obchodzić się z nimi ostrożnie w wyciągu. Rozsypany pył należy usunąć, wycierając go mokrym ręcznikiem papierowym (jeśli jest mokry, drobne cząstki są mniej rozproszone).
5 ) W dygestorium wlej adsorbent odmierzony w kolumnie do kolby Erlenmeyera (rys. 4 b), a następnie dodaj trochę eluentu (rys. 4 c). Wytworzyć luźną zawiesinę, wirując i mieszając szklanym mieszadłem (rys. 4 d), aż cały adsorbent będzie całkowicie mokry, pęcherzyki gazu zostaną uwolnione, a konsystencja będzie nieco gęsta, ale lejąca.
Rys.
a ) Wlewanie zawiesiny do kolumny, b ) Płukanie kolby, c) Adsorbent przylegający do boków kolumny, d ) Płukanie przylegającego adsorbentu
a ) Wlewanie zawiesiny do kolumny, b ) Płukanie kolby, c) Adsorbent przylegający do boków kolumny, d ) Płukanie przylegającego adsorbentu
6 ) Umieść zlewkę lub kolbę Erlenmeyera pod zaciśniętą kolumną i otwórz kurek. Jednym szybkim ruchem zawiruj i wlej zawiesinę krzemionki lub tlenku glinu do kolumny za pomocą lejka z dużym otworem (Rys. 5 a). Natychmiast użyj większej ilości eluentu do wypłukania pozostałości zawiesiny z kolby Erlenmeyera (rys. 5 b) i na kolumnę.
7) Natychmiast spłukać krzemionkę lub tlenek glinu z boków zbiornika kolumny za pomocą eluentu i ruchu wirowego pipety Pasteura (rys. 5 c i d). Pozostawiony do wyschnięcia adsorbent przylgnie do szkła i nie będzie można go łatwo spłukać.
7) Natychmiast spłukać krzemionkę lub tlenek glinu z boków zbiornika kolumny za pomocą eluentu i ruchu wirowego pipety Pasteura (rys. 5 c i d). Pozostawiony do wyschnięcia adsorbent przylgnie do szkła i nie będzie można go łatwo spłukać.
Rys.
a ) Popychanie kolumny w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, b ) Stosowanie ciśnienia powietrza, c) Dodawanie piasku, d ) Spłukiwanie piasku z boków.
a ) Popychanie kolumny w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, b ) Stosowanie ciśnienia powietrza, c) Dodawanie piasku, d ) Spłukiwanie piasku z boków.
8) Mocno potrząśnij kolumną za pomocą pierścienia korkowego lub kostek (rys. 6 a), aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza w kolumnie (które mogą powodować słabą separację lub pękanie adsorbentu w kolumnie) i promować równomierne osadzanie adsorbentu.
9) Zastosuj delikatne ciśnienie powietrza do górnej części kolumny (rys. 6 b), aby ją ścisnąć, zatrzymując się, gdy poziom eluentu znajduje się 1 cm od górnej części kolumny. Jeśli z przewodem powietrza używany jest adapter T, jak na rys. 6 b, precyzyjną kontrolę przepływu powietrza można uzyskać poprzez regulację zacisku na gumowej rurce. Podczas całego procesu elucji należy utrzymywać białą kolumnę adsorbentu mokrą, z poziomem eluentu powyżej górnej części krzemionki lub tlenku glinu. Delikatnie złamać uszczelkę, aby zaprzestać stosowania ciśnienia i zamknąć kurek, aby zapobiec dalszemu kapaniu cieczy.
10 ) Dodać cienką warstwę piasku (rys. 6 c) o wysokości około 0,5 cm. Przepłukać boki kolumny eluentem, wykonując ruchy wirowe, aby usunąć piasek z boków szklanki (rys. 6 d). Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby ciecz kapała, aż znajdzie się tuż nad warstwą piasku. Zastosuj ciśnienie powietrza, jeśli kapanie jest zbyt wolne.
9) Zastosuj delikatne ciśnienie powietrza do górnej części kolumny (rys. 6 b), aby ją ścisnąć, zatrzymując się, gdy poziom eluentu znajduje się 1 cm od górnej części kolumny. Jeśli z przewodem powietrza używany jest adapter T, jak na rys. 6 b, precyzyjną kontrolę przepływu powietrza można uzyskać poprzez regulację zacisku na gumowej rurce. Podczas całego procesu elucji należy utrzymywać białą kolumnę adsorbentu mokrą, z poziomem eluentu powyżej górnej części krzemionki lub tlenku glinu. Delikatnie złamać uszczelkę, aby zaprzestać stosowania ciśnienia i zamknąć kurek, aby zapobiec dalszemu kapaniu cieczy.
10 ) Dodać cienką warstwę piasku (rys. 6 c) o wysokości około 0,5 cm. Przepłukać boki kolumny eluentem, wykonując ruchy wirowe, aby usunąć piasek z boków szklanki (rys. 6 d). Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby ciecz kapała, aż znajdzie się tuż nad warstwą piasku. Zastosuj ciśnienie powietrza, jeśli kapanie jest zbyt wolne.
Dodaj próbkę
Po nałożeniu próbki na kolumnę rozpoczyna się wyścig z czasem, ponieważ dyfuzja zacznie poszerzać materiał. Próbka nie powinna być nakładana, dopóki nie będziesz gotowy do natychmiastowego ukończenia kolumny w całości. Proces ten może trwać od 15 do 90 minut! Jeśli używasz probówek do zbierania frakcji, probówki powinny być ułożone w stojaku przed dodaniem próbki, a wysokość kolumny powinna być dostosowana tak, aby stojak na probówki mógł wsunąć się pod spód.
a ) Rozpuszczanie ciała stałego w niewielkiej ilości dichlorometanu, b ) Nanoszenie próbki, c) Płukanie próbki w kolbie, d ) Naciskanie w celu wepchnięcia próbki na kolumnę tuż za warstwą piasku.
11) Jeśli surowa próbka jest cieczą, użyj jej bezpośrednio (przejdź do kroku 13).
12 ) Jeśli surowa próbka jest ciałem stałym, wykonaj jedną z poniższych czynności.
12 ) Jeśli surowa próbka jest ciałem stałym, wykonaj jedną z poniższych czynności.
a ) Sytuacja idealna: rozpuścić ciało stałe w minimalnej ilości eluentu (maksymalnie kilka ml).
b) Jeśli ciało stałe nie jest szczególnie rozpuszczalne lub nie rozpuści się w kilku ml eluentu, rozpuść je w minimalnej ilości dichlorometanu (maksymalnie kilka ml, rys. 7 a).
c ) Jeśli ciało stałe jest nierozpuszczalne w eluencie, możliwa jest również procedura alternatywna. Rozpuścić ciało stałe w kolbie okrągłodennej przy użyciu kilku ml niskowrzącego rozpuszczalnika (np. dichlorometanu lub acetonu). Dodaj do kolby około 1 g krzemionki lub tlenku glinu, a następnie usuń rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, aby pozostawić ciało stałe zawierające próbkę osadzoną na adsorbencie. Z centymetrową warstwą eluentu spoczywającą na wypełnionej kolumnie (pomiń dodawanie warstwy piasku, jeśli używana jest ta metoda), wylej zaadsorbowaną krzemionką próbkę na kolumnę za pomocą lejka z szerokim otworem. Jeśli jakikolwiek pył przylgnie do szkła, przepłucz je większą ilością eluentu (przejdź do kroku 15).
13) Delikatnie dodaj próbkę do kolumny za pomocą pipety, kapiąc ciecz lub roztwór bezpośrednio na piasek za pomocą końcówki pipety tak blisko, jak to możliwe, a nie po bokach (rys. 7 b). Należy uważać, aby nie wlewać płynu na siłę, co mogłoby spowodować wgniecenia w piasku lub kolumnie krzemionkowej / korundowej.
14) Przepłucz pojemnik na próbkę niewielką ilością rozpuszczalnika (lub dichlorometanu, jeśli jest używany, rys. 7 c) i dodaj popłuczyny do kolumny za pomocą tej samej pipety (aby przepłukać również pipetę).
15) Otwórz zawór odcinający i pozwól cieczy ściekać, aż próbka znajdzie się tuż za warstwą piasku (rys. 7 d) i w białym obszarze kolumny (zastosuj ciśnienie powietrza, jeśli zajmie to więcej niż 20 sekund).
16 ) Delikatnie przepłucz boki kolumny ruchem wirowym, używając 1-2 pipet wypełnionych eluentem, aby wypłukać rozbryzganą próbkę. Ponownie pozwól cieczy ściekać (lub zastosuj ciśnienie powietrza), aż próbka zostanie wepchnięta do białego adsorbentu.
Powtarzaj etap płukania, aż będziesz mieć pewność, że cała próbka została osadzona na adsorbencie. Jeśli część próbki nadal znajduje się w warstwie piasku, może rozpuścić się w eluencie po dodaniu większej ilości rozpuszczalnika, prowadząc do utraty wydajności. Jeśli związek jest zabarwiony, płukanie powinno być całkowicie klarowne.
14) Przepłucz pojemnik na próbkę niewielką ilością rozpuszczalnika (lub dichlorometanu, jeśli jest używany, rys. 7 c) i dodaj popłuczyny do kolumny za pomocą tej samej pipety (aby przepłukać również pipetę).
15) Otwórz zawór odcinający i pozwól cieczy ściekać, aż próbka znajdzie się tuż za warstwą piasku (rys. 7 d) i w białym obszarze kolumny (zastosuj ciśnienie powietrza, jeśli zajmie to więcej niż 20 sekund).
16 ) Delikatnie przepłucz boki kolumny ruchem wirowym, używając 1-2 pipet wypełnionych eluentem, aby wypłukać rozbryzganą próbkę. Ponownie pozwól cieczy ściekać (lub zastosuj ciśnienie powietrza), aż próbka zostanie wepchnięta do białego adsorbentu.
Powtarzaj etap płukania, aż będziesz mieć pewność, że cała próbka została osadzona na adsorbencie. Jeśli część próbki nadal znajduje się w warstwie piasku, może rozpuścić się w eluencie po dodaniu większej ilości rozpuszczalnika, prowadząc do utraty wydajności. Jeśli związek jest zabarwiony, płukanie powinno być całkowicie klarowne.
a i b) Napełnianie zbiornika rozpuszczalnika, c i d) Elucja kolumny
Napełnianiepłynem i elucja kolumny
17) Delikatnie dodaj więcej eluentu za pomocą pipety (Rys. 8 a), wirując po bokach, a następnie, gdy warstwa piasku nie będzie już naruszana przez dodatki, ostrożnie wlej większe ilości (Rys. 8 b) przygotowanego eluentu, aby wypełnić zbiornik (lub napełnij go taką ilością, jaka może być potrzebna). Czysty eluent zebrany podczas pakowania kolumny może być użyty ponownie.
18 ) Użyj ciśnienia powietrza, aby delikatnie i równomiernie eluować próbkę przez kolumnę (Rys. 8 c i d). Im więcej razy ciśnienie jest uruchamiane i zatrzymywane, tym większe prawdopodobieństwo pęknięcia kolumny. Najlepiej, jeśli ciśnienie może być utrzymywane na stałym i łagodnym poziomie przez cały czas.
Optymalna szybkość kroplenia podczas elucji zależy od wielkości kolumny. Idealny przepływ eluentu jest wtedy, gdy rozpuszczalnik w cylindrycznej części kolumny nad adsorbentem spada z prędkością 5 cm na minutę. W związku z tym szybkość kroplenia powinna być wolniejsza w przypadku wąskiej kolumny w porównaniu z szerszą kolumną. Szybkość kapania dla jednocalowej kolumny powinna być taka, aby poszczególne krople były ledwo rozróżnialne. Strumień cieczy wylewający się z zaworu odcinającego przy tym rozmiarze kolumny jest nieco zbyt szybki.
18 ) Użyj ciśnienia powietrza, aby delikatnie i równomiernie eluować próbkę przez kolumnę (Rys. 8 c i d). Im więcej razy ciśnienie jest uruchamiane i zatrzymywane, tym większe prawdopodobieństwo pęknięcia kolumny. Najlepiej, jeśli ciśnienie może być utrzymywane na stałym i łagodnym poziomie przez cały czas.
Optymalna szybkość kroplenia podczas elucji zależy od wielkości kolumny. Idealny przepływ eluentu jest wtedy, gdy rozpuszczalnik w cylindrycznej części kolumny nad adsorbentem spada z prędkością 5 cm na minutę. W związku z tym szybkość kroplenia powinna być wolniejsza w przypadku wąskiej kolumny w porównaniu z szerszą kolumną. Szybkość kapania dla jednocalowej kolumny powinna być taka, aby poszczególne krople były ledwo rozróżnialne. Strumień cieczy wylewający się z zaworu odcinającego przy tym rozmiarze kolumny jest nieco zbyt szybki.
a-c ) Zbieranie frakcji, d) Praca kolumny
Zbieraniefrakcji
19) Natychmiast rozpocząć zbieranie cieczy elucyjnej do probówek na stojaku (Rys. 9 a). Zalecenia dotyczące objętości do zebrania w każdej probówce znajdują się na Rys. 1.20 ) Po napełnieniu pierwszej probówki lub po zebraniu pewnej ilości płynu zgodnie z zaleceniami instruktora lub rys. 1, przesuń stojak, aby rozpocząć zbieranie do innej probówki (rys. 9 b i c). Probówki należy napełniać i utrzymywać w kolejności na stojaku.
Te różne probówki nazywane są "frakcjami". Celem kolumny jest zebranie wystarczająco małych frakcji, aby większość (lub niektóre) frakcje zawierały czysty materiał. Jeśli rozdzielenie mieszaniny jest trudne (jeśli ΔRf składników jest niskie), najlepszym rozwiązaniem może być zebranie małych frakcji (np. probówek wypełnionych do połowy).
Te różne probówki nazywane są "frakcjami". Celem kolumny jest zebranie wystarczająco małych frakcji, aby większość (lub niektóre) frakcje zawierały czysty materiał. Jeśli rozdzielenie mieszaniny jest trudne (jeśli ΔRf składników jest niskie), najlepszym rozwiązaniem może być zebranie małych frakcji (np. probówek wypełnionych do połowy).
a-c ) Materiał płuczący rozpryskany na końcówce kolumny, d) Uczniowie prowadzący kolumnę
21) Gdy ciecz spływa z kolumny, często rozpryskuje się na zewnątrz końcówki kolumny, a gdy rozpuszczalnik odparuje, na końcówce może pojawić się pierścień materiału (zobaczysz pierścień ciała stałego, jeśli składnik jest ciałem stałym, jak na rys. 10 b, lub oleiste kropelki, jeśli składnik jest cieczą). Jeśli składniki są zabarwione, końcówkę kolumny należy przepłukać (rys. 10 c), gdy wydaje się, że jeden składnik został całkowicie eluowany i zanim zbliży się drugi składnik.
22 ) Okresowo obserwuj poziom eluentu i uzupełniaj go, zanim spadnie poniżej warstwy piasku.
22 ) Okresowo obserwuj poziom eluentu i uzupełniaj go, zanim spadnie poniżej warstwy piasku.
a) Elucja, b ) Dodanie octanu etylu w celu zwiększenia polarności rozpuszczalnika, c) Poziom rozpuszczalnika zbliża się do warstwy piasku, d) Uzupełnianie.
Możliwe zwiększenie polarności rozpuszczalnika
23) Jeden eluent może być stosowany w całej kolumnie, zwłaszcza jeśli składniki do rozdzielenia mają podobne wartości Rf. Jeśli jednak składniki mają bardzo różne wartości Rf, polarność rozpuszczalnika można zwiększyć po elucji jednego składnika z kolumny (rys. 11 a).
Zwiększenie polarności rozpuszczalnika sprawi, że składniki będą przemieszczać się "szybciej". Istnieje kilka powodów, dla których pożądana jest szybsza elucja. Po pierwsze, jeśli jeden składnik opuścił już kolumnę, kolumna wykonała już swoją pracę z separacją, więc przyspieszenie procesu nie wpłynie na czystość zebranych frakcji. Po drugie, im dłużej trwa praca kolumny, tym szersze będą pasma składników (z powodu dyfuzji), a zebranie szerokiego pasma materiału zużyje (i zmarnuje) dużo rozpuszczalnika.
Zwiększenie polarności rozpuszczalnika sprawi, że składniki będą przemieszczać się "szybciej". Istnieje kilka powodów, dla których pożądana jest szybsza elucja. Po pierwsze, jeśli jeden składnik opuścił już kolumnę, kolumna wykonała już swoją pracę z separacją, więc przyspieszenie procesu nie wpłynie na czystość zebranych frakcji. Po drugie, im dłużej trwa praca kolumny, tym szersze będą pasma składników (z powodu dyfuzji), a zebranie szerokiego pasma materiału zużyje (i zmarnuje) dużo rozpuszczalnika.
Zawiera częściową listę serii eluotropowych, listę popularnych rozpuszczalników uszeregowanych według ich "mocy rozpuszczania" w chromatografii w fazie normalnej. Bardziej polarny rozpuszczalnik powoduje najbardziej dramatyczny wzrost Rf
24) Aby zwiększyć polarność rozpuszczalnika, rozpuszczalnik polarny można wlać bezpośrednio do eluentu w zbiorniku kolumny (Rys. 11 b). Na przykład, jeśli używana jest mieszanina heksanu i octanu etylu, dodanie czystego octanu etylu do eluentu znajdującego się obecnie w zbiorniku zwiększy jego polarność. Jeśli poziom eluentu jest niski, można przygotować roztwór zawierający wyższy procent bardziej polarnego składnika. Na przykład, jeśli kolumna najpierw używała mieszaniny heksanów i octanu etylu w stosunku 4:1, użycie mieszaniny 1:1 byłoby bardziej polarnym rozpuszczalnikiem.
25) Elucja kolumny przy użyciu bardziej polarnego rozpuszczalnika, tak jak poprzednio, i zawsze pamiętaj, aby obserwować poziom eluentu i uzupełniać go (rys. 11 d), zanim spadnie poniżej warstwy piasku.
26 ) Aby zwiększyć polarność rozpuszczalnika, rozpuszczalnik polarny można wlać bezpośrednio do eluentu w zbiorniku kolumny (rys. 11 b). Na przykład, jeśli używana jest mieszanina heksanu i octanu etylu, dodanie czystego octanu etylu do eluentu znajdującego się obecnie w zbiorniku zwiększy jego polarność. Jeśli poziom eluentu jest niski, można przygotować roztwór zawierający wyższy procent bardziej polarnego składnika. Na przykład, jeśli kolumna najpierw używała mieszaniny heksanów i octanu etylu w stosunku 4:1, użycie mieszaniny 1:1 byłoby bardziej polarnym rozpuszczalnikiem.
27) Elucja kolumny przy użyciu bardziej polarnego rozpuszczalnika, jak poprzednio, i zawsze pamiętaj, aby obserwować poziom eluentu i uzupełniać go (rys. 11 d), zanim spadnie poniżej warstwy piasku.
25) Elucja kolumny przy użyciu bardziej polarnego rozpuszczalnika, tak jak poprzednio, i zawsze pamiętaj, aby obserwować poziom eluentu i uzupełniać go (rys. 11 d), zanim spadnie poniżej warstwy piasku.
26 ) Aby zwiększyć polarność rozpuszczalnika, rozpuszczalnik polarny można wlać bezpośrednio do eluentu w zbiorniku kolumny (rys. 11 b). Na przykład, jeśli używana jest mieszanina heksanu i octanu etylu, dodanie czystego octanu etylu do eluentu znajdującego się obecnie w zbiorniku zwiększy jego polarność. Jeśli poziom eluentu jest niski, można przygotować roztwór zawierający wyższy procent bardziej polarnego składnika. Na przykład, jeśli kolumna najpierw używała mieszaniny heksanów i octanu etylu w stosunku 4:1, użycie mieszaniny 1:1 byłoby bardziej polarnym rozpuszczalnikiem.
27) Elucja kolumny przy użyciu bardziej polarnego rozpuszczalnika, jak poprzednio, i zawsze pamiętaj, aby obserwować poziom eluentu i uzupełniać go (rys. 11 d), zanim spadnie poniżej warstwy piasku.
a ) Oryginalna płytka TLC, b ) Frakcje zebrane przez kolumnę, c) Punktowe nanoszenie frakcji na płytkę TLC, d ) Wizualizacja płytki TLC próbek każdej frakcji.
Znajdowanie i zatężanie pożądanego składnika
28 ) W znalezieniu pożądanego składnika we frakcjach z probówki testowej pomocne jest zrozumienie zależności między Rf a kolejnością elucji w chromatografii kolumnowej.W chromatografii kolumnowej próbka jest osadzana na kolumnie i eluowana w dół, podczas gdy w chromatografii cienkowarstwowej próbka jest umieszczana na dnie płytki i eluowana w górę. Dlatego kolumnę można traktować jak odwróconą płytkę TLC. Związek o wyższym Rf działa "szybciej", co oznacza, że znajdzie się wyżej na płytce TLC i zostanie zebrany jako pierwszy za pomocą kolumny. W kolumnie przedstawionej w tej sekcji składnik o niższym Rf (pomarańczowy na płytce TLC na rys. 13a) jest składnikiem zbieranym jako drugi z kolumny.
29) Najpierw określ, które probówki zawierają rozpuszczony związek.
29) Najpierw określ, które probówki zawierają rozpuszczony związek.
a ) Umieść próbkę każdej frakcji na płytce TLC oznaczonej numerami frakcji odpowiadającymi kolejności, w jakiej zostały zebrane (rys. 13 c). Najlepiej jest umieścić każdą próbkę 2-3 razy jedna na drugiej, na wypadek gdyby frakcje były rozcieńczone.
b ) Jeśli zebrano wiele frakcji, co sprawia, że wahasz się pobrać próbkę każdej frakcji, jedną z metod identyfikacji bezbarwnych frakcji, które mogą zawierać związek, jest poszukiwanie śladu pozostałości prowadzącego probówki. Po odparowaniu, stała pozostałość (Rys.13) lub oleiste kropelki są czasami pozostawiane na górze probówki, co czyni oczywistym, że te frakcje zawierają więcej niż tylko rozpuszczalnik. Należy pobrać próbki wszystkich frakcji w pobliżu probówek zawierających widoczne pozostałości.
c) Wizualizacja płytki TLC z plamkami przy użyciu światła UV i/lub barwnika w celu określenia, które frakcje zawierają związek (Rys.13 d).
Rys.
a ) Wymyte płytki TLC frakcji zawierających możliwy związek, b ) Łączenie frakcji, c) Płukanie probówki z frakcją
a ) Wymyte płytki TLC frakcji zawierających możliwy związek, b ) Łączenie frakcji, c) Płukanie probówki z frakcją
28) Przeprowadzić TLC wszystkich frakcji zawierających związek, plamiąc do pięciu próbek na płytce TLC o szerokości 2,5 cm. W tym celu można użyć szerszych płytek TLC, jeśli są dostępne.
29) Zidentyfikuj związek z pożądanym Rf przez porównanie z oryginalną surową płytką TLC. Wybierz, aby zachować frakcje, które zawierają pożądany związek w czystej postaci, o czym świadczy eluowana płytka TLC. Na przykład, jeśli na rys. 15a pożądany jest związek o wyższym Rf, należy zachować frakcje 6-10.
30) Połączyć czyste frakcje w kolbie okrągłodennej o odpowiedniej wielkości (nie więcej niż do połowy, Rys.15 b). Przepłucz każdą probówkę niewielką ilością eluentu (lub innego rozpuszczalnika, jeśli rozpuszczalność jest problemem) i dodaj popłuczyny do kolby okrągłodennej (rys. 15 c).
31 ) Odparuj rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, aby pozostawić oczyszczony związek w kolbie.
29) Zidentyfikuj związek z pożądanym Rf przez porównanie z oryginalną surową płytką TLC. Wybierz, aby zachować frakcje, które zawierają pożądany związek w czystej postaci, o czym świadczy eluowana płytka TLC. Na przykład, jeśli na rys. 15a pożądany jest związek o wyższym Rf, należy zachować frakcje 6-10.
30) Połączyć czyste frakcje w kolbie okrągłodennej o odpowiedniej wielkości (nie więcej niż do połowy, Rys.15 b). Przepłucz każdą probówkę niewielką ilością eluentu (lub innego rozpuszczalnika, jeśli rozpuszczalność jest problemem) i dodaj popłuczyny do kolby okrągłodennej (rys. 15 c).
31 ) Odparuj rozpuszczalnik na wyparce obrotowej, aby pozostawić oczyszczony związek w kolbie.
Rys.
a ) Użycie ciśnienia powietrza do wysuszenia kolumny, b ) Pozostawienie kolumny do wyschnięcia do góry nogami, c ) Zebranie odpadowej krzemionki
a ) Użycie ciśnienia powietrza do wysuszenia kolumny, b ) Pozostawienie kolumny do wyschnięcia do góry nogami, c ) Zebranie odpadowej krzemionki
Czyszczenie kolumny
32 ) Aby osuszyć kolumnę, należy zastosować ciśnienie powietrza w celu odprowadzenia większości eluentu z kolumny do pojemnika na odpady. Następnie osusz kolumnę przy użyciu jednej z poniższych metod.
a ) Pozostawić podłączony delikatny strumień powietrza przepływający przez kolumnę w celu jej dalszego osuszenia podczas czyszczenia innych elementów (Rys. 16 a).
b ) Zacisnąć kolumnę do góry nogami nad dużą zlewką na odpady w wyciągu, tak aby adsorbent opadł po wyschnięciu (rys. 16 b). Zajmie to dużo czasu (do następnej lekcji), ale jest to opcja.
33 ) Po wyschnięciu adsorbent można wylać z kolumny do pojemnika na odpady w wyciągu (rys. 16 c).
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Sproszkowane adsorbenty mają działanie drażniące na płuca, a zagrożenie jest jeszcze większe, jeśli kolumna zawiera pozostałości związków, które mogą przedostać się do płuc. Wsypywanie proszków krzemionki lub tlenku glinu powinno zawsze odbywać się pod wyciągiem.
34 ) Gdy większość adsorbentu zostanie zebrana w pojemniku na odpady, użyj wody do spłukania wszelkich pozostałości stałych do zlewu, a następnie przepłucz kolumnę acetonem do zlewki na odpady. Następnie wyczyść kolumnę wodą z mydłem i wysusz z oddzielonymi częściami zaworu odcinającego.
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Sproszkowane adsorbenty mają działanie drażniące na płuca, a zagrożenie jest jeszcze większe, jeśli kolumna zawiera pozostałości związków, które mogą przedostać się do płuc. Wsypywanie proszków krzemionki lub tlenku glinu powinno zawsze odbywać się pod wyciągiem.
34 ) Gdy większość adsorbentu zostanie zebrana w pojemniku na odpady, użyj wody do spłukania wszelkich pozostałości stałych do zlewu, a następnie przepłucz kolumnę acetonem do zlewki na odpady. Następnie wyczyść kolumnę wodą z mydłem i wysusz z oddzielonymi częściami zaworu odcinającego.
Rozwiązywanie problemów
W kolumnie widoczne sąpęcherzyki powietrza
Pęcherzyk powietrza to pusta kieszeń, w której nie dochodzi do wyrównania fazy stacjonarnej i ruchomej, więc składniki poruszają się szybciej wokół pęcherzyka powietrza niż powinny. Może to prowadzić do nierównych pasm elucji, co może powodować nakładanie się, jeśli rozdzielenie mieszaniny jest trudne (jeśli składniki mają bardzo zbliżone wartości Rf, jak na rys. 17).
Jeśli w kolumnie widoczne są pęcherzyki powietrza, a piasek lub próbka nie zostały jeszcze nałożone, należy dobrze wstrząsnąć kolumną podczas pakowania, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Skontaktuj się z instruktorem, jeśli pęcherzyki nie drgną, ponieważ być może podchodzisz do zadania zbyt delikatnie. Jeśli piasek lub próbka zostały już naniesione, najlepiej pozostawić kolumnę bez zmian i mieć nadzieję, że pęcherzyki powietrza nie wpłyną na separację.
Pasma eluują nierównomiernie
Jeśli składniki mieszaniny są kolorowe, może to być oczywiste, gdy pasma eluują w krzywy sposób. Jest to najprawdopodobniej spowodowane tym, że kolumna jest zaciśnięta pod niewielkim kątem. Jeśli kolumna jest zaciśnięta w sposób ukośny, składniki będą przemieszczać się w sposób ukośny (Rys. 18). Może to powodować problemy z separacją, jeśli komponenty mają podobną wartość Rf.
rzywionej kolumny na separację
Nie ma sposobu na rozwiązanie tego problemu w połowie kolumny, ale jeśli komponenty mają bardzo różne wartości Rf, ukośne pasma mogą nie mieć wpływu na separację. W przyszłości należy sprawdzić, czy kolumna jest idealnie pionowa zarówno w kierunku bok-bok, jak i przód-tył.
Last edited by a moderator:
